1. Jak vznikl nápad věnovat se právě vývoji vakcíny proti HIV?

    Milan Raška. S tímto tématem jsem se setkal během svého dvouletého pobytu ve Spojených státech na University of Alabama at Birmingham v laboratoři prof. Městeckého a prof. Nováka.  Zde jsem poznal enormní variabilitu a unikátní chemickou strukturu obalového proteinu HIV viru, díky které virus uniká dozoru protilátek navozených u většiny infikovaných. V populaci HIV-1 pozitivních však byla popsána malá skupina jedinců schopných, z ne zcela objasněných důvodů, produkovat protilátky schopné neutralizovat extrémně široké spektrum variant HIV-1 viru a protilátky od těchto jedinců se staly základem nápadu použít je k přípravě vhodného molekulárního otisku, který by byl schopen podobné protilátky po imunizaci navodit u většinové populace. Příprava takových otisků pomocí technologie extrémně variabilních proteinových knihoven, s nimiž úspěšně pracovala skupina výzkumníků pod vedením Dr. Petra Malého, se stala atraktivním cílem společné studie.

    Petr Malý. Prof. Raška za mnou přišel v roce 2014 s nápadem využít námi zavedenou a úspěšně vyzkoušenou technologii selekce vazebných proteinů z vysoce komplexní kombinatoriální knihovny odvozené od struktury malé proteinové domény jednoho z proteinů streptokoka, tzv. ABD knihovny. My jsme tuto technologii vyvíjenou v naší Laboratoři inženýrství vazebných proteinů na Biotechnologickém ústavu AVČR od roku 2008 do té doby výhradně používali k vývoji diagnostických vazebných proteinů jako alternativ k monoklonálním protilátkám a k vývoji nových potenciálně terapeutických proteinových blokátorů. Vtip tohoto inovativního nápadu spočíval v tom, že „vylovíme“ z naší knihovny o komplexitě desítek až stovek bilionů variant několik kandidátů, kteří by mohli působit jako účinné imunogeny stimulující tvorbu neutralizujících protilátek proti viru HIV-1. Nápad to byl fascinující a zcela revoluční, ale dosud pro vývoj jakékoliv vakcíny nevyzkoušený. Protože však jiné cesty k vývoji účinné ochranné vakcíny proti infekci HIV dosud selhaly, dohodli jsme se na spolupráci a připravili společně velmi ambiciózní, ale také nesmírně riskantní vědecký projekt.

    1. Riziko neúspěchu je součástí vědeckého poznání, čeho jste se báli nejvíce?

    Petr Malý. Těch úskalí byla celá řada. Strategický problém byl ten, že celý projekt byl postaven na úspěšné identifikaci proteinových variant identifikovaných z proteinové knihovny, ale k tomuto unikátnímu přístupu neexistovala relevantní záložní varianta, která by navržený způsob řešení v projektu obešla. Dalším úskalím bylo to, že jsme hledali jen velice ojedinělou skupinu vazebných proteinů, které rozpoznávají velice omezenou oblast na povrchu neutralizující protilátky zvanou paratop, pro který musí být náš vazebný protein specifický. Nalézt takové ojedinělé varianty ve společenství bilionů variant vyžadovalo zavést nový efektivní způsob testování, aby nám takový protein při analýze neproklouzl. Další pro nás dosud neznámou obtíží bylo to, že jsme se nemohli spolehnout na námi kvalitně připravený a funkčně ověřený protein jako molekulární terč, ale na darovanou a komerčně nedostupnou protilátku předpokládané kvality, jejíž množství bylo limitováno na dvě zkumavky za rok, což zásadně omezovalo kontrolní a přípravné experimenty a statistický rozsah následného testování. Další „sázkou do loterie“ pak bylo zvolit jednu z deseti možných neutralizačních protilátek, na které jsme chtěli náš přístup poprvé vyzkoušet. Další zásadní rozdíl od dřívějších zkušeností bylo to, že zatímco funkci diagnostického nebo blokačního proteinu ověříte za jeden či několik dnů, tady se dozvíte výsledek až po 3 až 4 násobné imunizaci zvířat v řádu týdnů až měsíců. Vezmeme-li v úvahu, že projekt byl postaven na nevyzkoušeném nápadu, neměli jsme k dispozici řadu předběžných a podpůrných dat a postupy vyvíjeli „za pochodu“, dá se říci, že to byl projekt postavený „na zelené louce“.

    1. Předpokládám, že ambice vyvinout očkovací látku má více vědeckých kolektivů ve světě. Máte přehled, jakými cestami se ubírají a jak jsou daleko?

    Petr Malý. Vývoj vakcíny proti infekci virem HIV začal nedlouho po tzv. „Černém pátku“ 5. června 1981, kdy se v Los Angeles v USA objevila krátká zpráva rutinního zpravodaje „Centra pro kontrolu nemocí“ popisující prvních pět případů jinak zdravých mladých mužů hospitalizovaných s těžkým zápalem plic způsobeným tehdy neznámou nemocí s následným selháním imunitního systému, později nazvané AIDS. Tak jak se nemoc šířila a stávala se epidemií, tak se do vývoje účinné vakcíny postupně zapojovaly stovky týmů po celém světě, vytvořilo se několik konsorcií specializujících se na vývoj terapeutických protilátek, retrovirových inhibitorů i HIV vakcíny, a přidali se také soukromí investoři a soukromé nadace, např. Melindy a Billa Gatesových. Časem se ukázalo, že oproti jiným virovým onemocněním s úspěšným vývojem vakcín představuje vakcína proti HIV dosud nejsložitější vědecky pokořitelný vakcinační problém.

    Milan Raška. Ano. Sledujeme vývoj vakcíny proti HIV-1. Zřejmě nejvýznamnější roli hrají výzkumníci v USA. Ti se ubírají jinou cestou, založenou na přípravě různě modifikovaných proteinových chimér odvozených od přirozeného obalového proteinu viru HIV-1, který je cílem neutralizačních protilátek. Chiméry by měly snadněji navodit neutralizační protilátky v široké populaci. Návrhy takových chimér jsou založeny na nejnovějších poznatcích o fungování imunitního systému při virových infekcích, poznatcích o mechanismech rozvoje autoimunitních chorob a poznatcích ze strukturní proteinové biologie. Přes enormní úsilí výzkumníků, překrásné publikace a povzbuzující sdělení, která se občas objeví v mediích, není doposud k dispozici žádná vakcína k účinné prevenci HIV infekce.

    1. V čem spočívá zásadní obtíž s vývojem vakcíny proti HIV?

    Milan Raška. Důvodů, proč je tak obtížné neutralizovat HIV-1 virové částice, je více. Virus má mohutný cukerný (glykanový) štít na povrchu obalového glykoproteinu Env, který brání neutralizujícím protilátkám v přístupu ke klíčovým vazebným doménám nutným k rozpoznání a pevnému ukotvení viru k cílové buňce člověka – T-lymfocytu. Protože počet molekul Env na povrchu HIV-1 je velmi malý, nemohou protilátky na povrchu specifických buněk – B lymfocytů – využít zesilovacího efektu přemostění sousedních Env terčů a aktivace imunitní protilátkové odpovědi je tak slabá. Navíc virové částice maskují klíčové epitopy změnou sbalení-konformace Env proteinu v období volného šíření v mezibuněčném prostoru a po prvním kontaktu s cílovou buňkou (T-lymfocytem). Největší překážku však představuje obrovská variabilita zejména virového obalového proteinu Env, která je výsledkem extrémně vysoké frekvence mutací, jejichž limitací je pouze zachování funkce Env při zahájení infekce cílových buněk člověka. HIV-1 virové částice tak účinně unikají z imunitního dozoru hostitele.

    1. Na čem je postaven princip Vašeho přístupu k řešení problematiky? Můžete vysvětlit mechanismus působení Vámi vyvíjené vakcíny?

    Petr Malý. V principu jde o to, že při konstrukci vakcíny nepoužíváme části HIV-1 viru či od nich odvozené antigenní struktury, jako jiné výzkumné skupiny nejen u HIV, ale u většiny infekcí. Základ našeho přístupu vychází z faktu, že existují a jsou dostupné unikátní protilátky, které neutralizují obrovské spektrum variant HIV-1, a k těmto protilátkám jsme připravili proteinové otisky. Proteinový otisk je založen na výběru vhodné molekuly, která díky tvarové komplementaritě svého povrchu s povrchem specifického místa na protilátce (paratopem) je schopna navodit silnou mezimolekulární interakci představenou jako silná vazebná afinita. Takové varianty byly schopny navodit v sérech imunizovaných zvířat tvorbu protilátek podobných vlastností jako ty původní popsané u vybraných HIV-infikovaných jedinců. Výhoda je, že připravené proteinové otisky jsou pro imunitní systém dobrý cíl, jsou dobře vyrobitelné, jsou levné a dostatečně stabilní, aby se daly v budoucí vakcíně distribuovat na velké vzdálenosti snadněji, než současně testované HIV či jiné vakcíny. Navíc oproti cukerným imunogenům dokáže navodit dlouho trvající imunitní ochranu.

    1. Jak jste daleko s vývojem a jaké jsou současné výsledky?

    Petr Malý. V současnosti máme k dispozici tři kolekce mimikujících rekombinantních vazebných proteinů, které naznačily svoje schopnosti vyvolat tvorbu neutralizujících protilátek proti obalovému proteinu HIV viru po imunizaci myší. Potěšitelné je, že tyto proteiny navozují tvorbu protilátek neutralizujících široké spektrum HIV variant. Všechny tyto identifikované a ověřené proteiny byly ochráněny dvěma mezinárodními patentovými přihláškami a část z nich je i pod ochranou již uděleného českého patentu.  V současnosti jsou jednotlivé varianty testovány v kombinaci u experimentálních zvířat s cílem ještě rozšířit efektivitu vakcinace proti HIV. Průběžně probíhá hledání vhodného strategického investora, který by podpořil další preklinické testování směřující k vývoji konceptu prototypu vakcíny ověřené na opičím modelu s cílem směřovat ke klinickým studiím u člověka. Předpokládáme také součinnost investora při vstupu patentové ochrany do národních fází.

    1. Nedávno i mezi vědci vznikl spor, zda má v ČR význam vyvíjet vlastní vakcínu proti covidu 19, protože nemáme dost ani výrobních ani finančních kapacit. Předpokládám, že i vy nad tím přemýšlíte. V případě úspěchu vývoje, jak si představujete cestu jeho uvedení do praxe? Nebojíte se, že i úspěšný výzkum může skončit bez reálné výroby vakcíny?

    Petr Malý. V současné situaci bychom rádi ověřili náš koncept vývoje mimikujících proteinů jako alternativní a doplňkové strategie tam, kde klasické postupy vývoje vakcín selhávají. Je několik virových infekcí, kde by se dal náš navržený koncept aplikovat. Abychom pokročili dále, snažíme se posunout v preklinických studiích a dokončit patentovou ochranu vyvinutých vazebných proteinů. Pokud se ukáže v dalších testech náš přístup za životaschopný, pak bude otázka klinického testování a výroby vakcíny relevantní. Na rozdíl od nyní již rutinního vývoje a produkce vakcín na COVID-19 by mohlo být pro některé výrobce velmi zajímavé vyzkoušet naši strategii pomocí imunizace mimikujícími proteiny či využít DNA/RNA sekvencí tyto proteiny kódujících. Vývoj by mohla významně urychlit spolupráce se zavedenou společností s technologiemi a zkušenostmi s výrobou vakcín. Pokud by se podařilo takového investora či strategického spolupracujícího partnera najít, šance na vývoj vakcíny se značně zvýší. Riziko, že náš výzkum skončí bez reálné výroby HIV vakcíny je značné, ale přesto má smysl se o vakcínu pokusit.

    Milan Raška. Jsme si vědomi možných komplikací s uvedením vakcíny k životu a reálnému klinickému využití. Předpokládáme, že studie plánované k provedení ve spolupráci s vybranou biotechnologickou společností, jasně prokáže, zda je naše cesta přípravy vakcíny k předcházení infekce HIV životaschopná a zda vakcinační konstrukty navodí ochranné neutralizační protilátky u experimentálních opic. Pokud ano budeme buď my, nebo nabyvatel licence na naše vakcinační konstrukty hledat strategického partnera k financování řádných klinických studií. I zde samozřejmě stojí otázka účinnosti a bezpečnosti našeho vakcinačního přístupu a odpověď na ni může dát jedině klinická studie. Jelikož doposud neexistuje vakcína k předcházení HIV infekce, můžeme oprávněně očekávat, že pokud náš přístup bude účinný a bezpečný, zájem ze strany farmaceutických firem bude.

    1. Nikdy se veřejnost nezajímala o viry tak intenzivně, jako nyní při covidové pandemii. Z hlediska Vašeho pohledu, zda je cesta porazit tento druh viru? Na co by se měla věda nyní soustředit? Mám dojem, že v centru pozornosti byly epidemiologové, už méně jsme ale slyšeli názory virologů či imunologů, což kritizovala např. prof. Říhová. Mají tyto vědní obory co říci do boje s pandemiemi a co si myslíte, že v diskusích nezaznělo dostatečně výrazně?

    Milan Raška. Virologie a imunologie stály za vývojem a úspěšným zavedením vakcín k prevenci rozvoje infekce COVID-19. Všechny schválené vakcíny chrání vakcinovaného jedince před smrtí a před nutností hospitalizace. V souladu s objevením se nových variant COVID-19 vystupuje ještě více do popředí význam imunologie, která prokazuje, že je schopna nabídnout nové vakcíny účinné proti těmto variantám, a to ve velmi krátkém čase. Poměrně málo pozornosti bylo však doposud věnováno slizniční imunitě a jejímu zapojení do obrany proti COVID-19 infekci. Přitom se jedná o první barieru, se kterou se SARS-CoV-2 virus setká, a která u většiny lidí efektivně brání rozvoji závažné systémové infekce a jejím komplikacím. Na sliznici se uplatňují jak mechanismy nespecifické obrany, a to bezprostředně po kontaktu s virem, tak i mechanismy přísně rozlišující struktury SARS-CoV-2 viru, což se odehrává s několikadenním zpožděním. Jelikož se slizniční imunitní systém chová v mnohých aspektech odlišně od běžně popisované systémové imunity, je třeba mu věnovat zvýšenou pozornost. Například slizniční protilátky třídy IgA, které dominují na sliznicích horních cest dýchacích, mohou zabránit nejen viru ve vstupu do organismu, ale mohou i potlačit zánětlivou reakci. Naopak, protilátky v dolních cestách dýchacích proti stejným částem viru, které jsou však jiného izotypu, sice brání viru v infekci buněk, ale kromě toho podporují zánětlivou reakci, která může přispět k poškození organismu, jak jsme mohli u některých jedinců pozorovat. Je obecným problémem, že se slizniční imunitě věnuje podstatně méně výzkumníků oproti těm, kteří se věnují imunitě systémové, která se uplatňuj uvnitř organismu – a s tím souvisí absence detailnějších poznatků o jejím zapojení do obrany proti SARS-CoV-2  infekci.

    1. Když se podíváme do budoucnosti, kterému problému byste se chtěli věnovat a proč?

    Milan Raška a Petr Malý. Technologie vakcín, o které jsme se zmínili, je uplatnitelná u širokého spektra infekcí virových a bakteriálních, ale i jiných. Již jsme zahájili experimenty testující její využití u dalších virových infekcí, kde by mohla tato technologie překonat současné potíže bránící vývoji účinných vakcín.  To se týká například virové Hepatitidy typu C, ale chceme ověřit využití našeho konceptu i v rámci nemoci COVID-19. Strategie vývoje vazebných proteinů jako alternativy k monoklonálním protilátkám je uplatnitelná u mnoha dalších nemocí a stavů, ale je výhodná také pro in vitro a in vivo diagnostiku. Společně nyní vyvíjíme strategie zpřesňující odhad odpovědi některých nádorů na moderní biologickou léčbu. Získali jsme i mezinárodní grantovou podporu na vývoj nových vazebných proteinů k terapii zánětlivých onemocnění střev. V tomto projektu se snažíme nejen připravit nové vazebné proteiny schopné tlumit ve střevech nežádoucí zánětlivou dráhu, ale i otestovat velmi atraktivní formu podání protizánětlivých látek sekretovaných ve střevě pomocí orálně aplikovaných neškodných probiotických střevních bakterií. Pokud by se tento přístup osvědčil, mohly by se probiotické bakterie nekolonizující střevní epitel, například Lactococcus lactis sekretující proteinové protizánětlivé blokátory, podávat během terapie například v podobě mléčných výrobků jako je třeba jogurt.